徐锡麟到达安徽省城安庆后，担任安徽陆军小学堂会办。1907年3月，升任安徽巡警处会办兼巡警学堂会办、陆军小学堂监督，他以巡警学堂为主要活动基地，酝酿武装起义。

　　1907年2月，秋瑾任大通学堂督办后，实际上承担了领导浙江全省革命运动的任务。她以大通学堂为中枢，与各地会党首领联系，并到杭州与浙江新军中的革命党人接洽。为了将分散各地的会党联合起来，秋瑾强化了光复会组织系统，将光复会会员分成16级，以徐锡麟为首领，秋瑾任协领，竺绍康、王金发、张恭、吕熊祥等各会党头目任分统。经过陈伯平等居间联系，徐锡麟、秋瑾达成了详细周密的浙江、安徽两省同时起义的计划。

　　7月初，起义计划泄露，时机紧迫，徐锡麟在来不及通知秋瑾的情况下，临时决定于7月6日在安徽巡警学堂毕业典礼上起义。当天上午8时，当安徽巡抚恩铭等文武官员进入典礼会场就座后，徐锡麟与陈伯平、马宗汉同时向恩铭开枪，当场将其击毙，然后宣布起义，带领学生数十人冲向军械所，同时通知事先已经有联络的安徽新军将领带队入城，准备一举占领安庆省城。但由于城门已经关闭，这些计划都未能实行。徐锡麟与他率领的起义学生很快被清军团团包围，双方展开激战，战至下午，陈伯平与4名学生战死，徐锡麟、马宗汉以及40余名学生被俘。

　　7月7日，徐锡麟从容就义，并被官府残忍地挖心祭祀恩铭。8月25日，马宗汉也被杀害。徐锡麟等牺牲后，浙江起义计划暴露，当局随即派兵前往绍兴捉拿秋瑾。7月15日凌晨4时，秋瑾在绍兴轩亭口壮烈就义。与秋瑾同时牺牲的还有程毅、徐顺达、吕阿荣、裘文高等多位革命志士。浙皖光复军起义虽然失败了，但对清政府的打击是十分沉重的。指挥镇压安庆起义的清两江总督端方哀叹说：“吾等自此以后，无安枕之日矣！” 清朝官吏大有人人自危、草木皆兵之景象。